Anoectochilus roxburghii

Nachdem wir die Fähigkeit dieses Ansatzes beim Screening von UDPglucose-Glykosyltransferasen der Modellpflanze A. thaliana gezeigt hatten, wandten wir den gleichen Ansatz auf eine lokale Heilpflanze A. roxburghii in Fujian, China, an, um ihre Glykosyltransferasen zu screenen, die eine wesentliche Rolle bei der Synthese ihrer biologisch aktiven natürlichen Produkte spielen. Um die Sequenzinformationen aller mutmaßlichen UDP-Glucosyltransferasen zu erhalten, führten wir eine Transkriptomsequenzierung an dieser Pflanze durch. Die Transkriptomdaten von A. roxburghii wurden durch Illumina HiSeqTM 2000 Sequenzierung in unserer vorherigen Studie (Zou et al., 2019) erhalten. Zuerst extrahierten wir die gesamte RNA von A. roxburghii, und mRNA wurde durch Oligo (dT)-Beads angereichert. Anschließend wurde die angereicherte mRNA unter Verwendung von Fragmentierungspuffer in kurze Fragmente fragmentiert und mit Zufallsprimern in cDNA revers transkribiert. Zweitstrang-cDNA wurde durch DNA-Polymerase I, RNase H, dNTP und Puffer synthetisiert. Anschließend wurden die cDNA-Fragmente mit QiaQuick PCR-Extraktionskit gereinigt, endrepariert, poly(A) zugegeben und an Illumina-Sequenzierungsadapter ligiert. Die Ligationsprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese größenselektiert, PCR amplifiziert und mit Illumina HiSeqTM 2000 sequenziert. Aus den Rohablesungen wurden Lesewerte mit Adaptern, Lesewerte mit mehr als 10 % unbekannter Nukleotide (N) und Lesewerte von geringer Qualität entfernt. Die daraus resultierenden sauberen Lesungen wurden weiter zusammengestellt, um qualitativ hochwertige Transkripte zu identifizieren. Die Montage von Transcriptome de novo wurde mit einer Kurzleser-Montagesoftware Trinity durchgeführt. Insgesamt wurden 58.065 Transkripte mit einer mittleren Länge von 806 bp und einer N 50 von 1347 bp zusammengestellt. Somit bieten diese Daten eine gute Grundlage für das anschließende Screening von vermeintlichen UDP-Glucosyltransferasen (Zou et al., 2019). Dann haben wir das BLASTx-Programm mit einem E-Wert-Schwellenwert von 1 e 5 für die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -Datenbank verwendet, und Proteinfunktionalannotationen konnten erhalten werden. Da jedes Sequenz-Alignment-Ergebnis mehr als einen Treffer haben kann, um seine biologische Bedeutung sicherzustellen, wurde ein optimales Alignment-Ergebnis als Annotation des Gens beibehalten. Insgesamt 96 UDP-Glucosyltransferase-verwandte Gene wurden mithilfe der KEGG-Datenbank entdeckt. Schließlich haben wir die getORF-Software verwendet, um 27 Glykosyltransferasen mit einem offenen Leserahmen (ORF) zu filtern (Wang et al., 2019; Zhang et al., 2021) (Tabelle 2). Wir verwendeten dann die reverse-transcribed cDNA von A. roxburghii als Vorlage und amplifizierten diese ArUGTs Gene mit PCR. Wir haben erfolgreich 11 verschiedene lineare DNAs erzeugt, die für die TX-TL-Reaktion bereit sind. Dann exprimierten wir die entsprechenden Glykosyltransferasen in TX-TL und testeten ihre Glykosylierungsaktivität mit Quercetin, da es das repräsentativste Flavonoid-Aglykon ist. Nach Analyse von Reaktionsprodukten mit UPLC-MS fanden wir heraus, dass 6 ArUGTs eine signifikante Glykosyltransferaseaktivität in TX-TL-Reaktionslösungen besaßen (siehe Abb. 3, Ergänzende Abb. S 5). Ein Vergleich des Chromatogramms des Quercetin-Standards, des Chromatogramms des Isoquercitrin-Standards und der Chromatogramme der glykosylierten Produkte zeigte, dass diese 6 ArUGTs - AR 06047, AR 06981, AR 07558, AR 11662, AR 14572 und AR 43718 - die Umwandlung von Quercetin in Isoquercitrin katalysieren können Abb. Die übrigen 5 ArUGTs (AR 07805, AR 40806, AR 47165, AR 14280, AR 42458) zeigten dagegen keine signifikante Glykosyltransferase-Aktivität. Da Enzyme Substratspezifität haben, besteht der Hauptzweck dieser Studie darin, ein Verfahren zum schnellen Screening von UGTs aus Pflanzen zu etablieren und zu verifizieren. Es ist bekannt, dass A. roxburghii eine Vielzahl von Quercetinglycosiden enthält, so dass wir vorerst nur Quercetin als Substrat gewählt haben, um nach neuen Enzymgenen zu suchen. Diese vermeintlichen Enzyme, die Quercetin nicht katalysieren können, können katalytische Aktivität auf anderen Substraten haben. Wir werden den Umfang des Substratscreenings in Folgestudien weiter ausbauen. Als positive Ergebnisse haben wir erfolgreich 6 neue ArUGTs herausgesucht, die eine signifikante Glykosyltransferaseaktivität auf Substrat Quercetin mit dieser potenziellen Strategie unter 11 verschiedenen linearen DNAs zeigten, die in der TX-TL-Reaktion exprimiert wurden (Ergänzungstabelle S 2).